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针对新冠病毒的基于CRISPR-Cas体系的分子诊断及医治战略###

中文择要

以后新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情仍在环球大盛行,确诊病例和殒命人数仍不停攀升,怎样无效控制病毒的传达,低落感染率和殒命率是现在全人类亟待办理的题目。一方面必要疾速、牢靠、经济的检测办法实时发明新型冠状病毒(SARS-CoV-2)熏染者,另一方面必要寻觅新鲜、无效的COVID-19医治及防备战略。种种基于CRISPR-Cas体系的新一代基因编辑技能以其疾速、便携、经济、高效的特点为COVID-19疾速分子诊断提供理解决方案。CRISPR-Cas体系具有可正确辨认并降解SARS-CoV-2核酸的特点,为研发针对COVID-19的新型医治及防备手腕提供了一种潜伏的技能方案。此文对现在COVID-19诊断及医治近况举行了剖析,对基于CRISPR-Cas体系的COVID-19分子诊断、医治及防备战略研讨及其新停顿举行了简述。

注释

以后,由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情仍在环球180多个国度和地域继续伸张,严峻危及环球大众卫生系统和人类生命宁静。据WHO统计,停止2021年12月29日,环球累计COVID-19确诊病例超2.81亿,累计殒命人数达541万。多种SARS-CoV-2变异株的连续呈现,尤其是在英国初次检测到的B.1.617变异株(德尔塔毒株)(包罗其亚变种AY.4.2)和克日在南非初次检测到的B.1.1.529变异株(秘密克戎毒株)具有传达力强、埋伏期短、致病性强、发病历程快等特点,已招致环球多国疫情呈现反弹。这对举行有针对性的COVID-19临床诊治及防备战略提出了更高的要求。基于成簇纪律距离短回文反复序列及其相干卵白(clustered regularly interspaced short palindromic repeat and associated protein,CRISPR-Cas)体系的基因编辑技能近几年开展敏捷,使用范畴简直延伸到生命迷信的每个角落[2]。基于CRISPR-Cas体系的种种病原体核酸检测办法,不必要庞大昂贵的设置装备摆设、操纵复杂,极大地增加了实行室负荷和患者检测本钱,使得现场即时检测(point of care test,POCT)得以完成,可赶早地追踪和断绝被熏染人群,疾速阻断病毒传达[3]。诸多研讨已实验将该技能使用到COVID-19的晚期诊治及防备,以期开辟出愈加敏捷疾速的病毒核酸检测办法和宁静无效的新型医治及防备方案。本文在简述现在COVID-19诊治近况的底子上,对基于CRISPR-Cas体系的COVID-19分子诊断、医治及防备战略的研讨及其新停顿举行扼要介绍。

1、COVID-19诊治近况
1.1、常用的SARS-CoV-2检测办法

SARS-CoV-2完备的基因组约为30 kb,此中靠近5’真个前2/3包括编码16个非布局卵白的开放阅读框1ab(open reading frame 1ab,ORF1ab)基因,后1/3包括编码布局卵白的基因包罗包膜卵白(envelope protein,E)、刺突卵白(spike protein,S)、核衣壳卵白(nucleocapsid protein,N)、膜卵白(membrane protein,M)基因。

定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)现被作为COVID-19诊断的金尺度,WHO和我国均发起选用至多包括针对ORF1ab和N基因地区的qRT-PCR核酸检测试剂盒(包括TaqMan聚合酶、引物和探针)作为COVID-19确诊办法。但在熏染晚期qRT-PCR检测仍可呈假阴性,同时有检测本钱贵、样本运转/检测周期长以及职员和设置装备摆设要求初等缺陷。使用直接免疫荧光法、间接发光免疫法、ELISA、胶体金免疫层析等技能检测呼吸道排泄物中的SARS-CoV-2抗原或血清抗体,也被列国作为SARS-CoV-2熏染诊断或医治监测的帮助手腕。固然这些免疫学检测抗原或抗体的试剂有的已上市并使用于临床检测,但仍存在交织反响、检测窗口期较长、假阳性率初等很多缺陷。

1.2、现在COVID-19的医治与防备手腕

迄今为止,环球列国曾经评价了种种大概的COVID-19医治与防备手腕,此中包括多种化学药物、中和抗体和种种处于差别临床实验阶段或曾经上市的疫苗。关于COVID-19具有潜伏疗效的候选药物有瑞德西韦、洛匹那韦、氯喹和羟氯喹、法匹拉韦等,固然这些候选药物在小范围临床实验中均被证明具有肯定的抗SARS-CoV-2活性,但在WHO牵头构造的环球最大用于评价COVID-19医治办法的临床实验——“勾结”实验(SOLIDARITY trial)中瑞德西韦、羟氯喹、洛匹那韦对COVID-19的医治结果都非常有限乃至有效。好音讯是法匹拉韦已在多个国度的临床实验中展示出无效性,尤其是针对轻症和中症患者的医治,而且在包罗中国在内的多个国度上市;近来,抗SARS-CoV-2口服药Molnupiravir获英国药监局同意上市,用于成人轻症至中症COVID-19的医治;美国辉瑞公司新口服药PAXLOVIDTM的Ⅱ/Ⅲ期临床实验后果表现,该药可使患者重症大概殒命危害低落89%,现在已向美国FDA提交告急利用受权(emergency use authorization,EUA)请求。清肺排毒汤、化湿败毒方、宣肺败毒颗粒、金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、血必净注射液等3其中药方子和3其中成药已被证明对COVID-19有分明疗效,团结西药医治可分明进步治愈率。

中和抗体疗法也是医治COVID-19的一个抢手范畴,如从COVID-19病愈患者的规复期血浆中挑选出的单克隆中和抗体,经过与SARS-CoV-2的S卵白联合,阻断病毒与宿主细胞联合,病毒无法侵入细胞,终极被免疫体系清除。环球现有20种中和抗体药物研发进入临床实验,此中美国礼来公司和上海君实生物医药科技有限公司[yǒu xiàn gōng sī]互助开辟的Etesevimab/Bamlanivimab团结疗法、美国再生元制药公司的卡西瑞单抗和伊德单抗组合疗法、美国VirBiotechnology公司和英国葛兰素史克公司互助的Sotrovimab均已取得美国FDA的EUA。

针对环球COVID-19疫情的爆发及伸张,天下列国都加速了疫苗的研发、消费及审批,以致受权应急利用审批速率,以满意进步大众群体免疫程度、无效控制疾病盛行必要。WHO于2021年10月28日更新的COVID-19疫苗告急利用名单表现,24种COVID-19候选疫苗中已经过认证并获准告急利用的仅14种(包罗我国2种),其他10种疫苗尚未完成相干认证。别的,WHO近来公布的环球COVID19疫苗开辟概略标明,已有322种候选疫苗,此中128种处于临床实验阶段。现在已有的COVID-19疫苗包罗灭活疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗、重组亚单元疫苗等。随着愈加深化的研讨,核酸疫苗在免疫原性、宁静性和继续性方面都取得了极大的前进,此中为应对COVID-19疫情初次利用的mRNA疫苗尤为引人存眷。mRNA具有精良的掩护效能且宁静性可控,可在体内正常降解,实际上不会与宿主基因整合,与传统疫苗相比,消费周期更短、研发本钱更低,但运输与保管条件的要求更高。现在,美国辉瑞公司/德国BioNTech公司团结研制的BNT162b2 mRNA疫苗以及美国Moderna公司开辟的mRNA-1273疫苗已取得告急利用同意上市。

2、基于CRISPR-Cas体系的COVID-19分子诊断
2.1、基于CRISPR-Cas13的COVID-19诊断

Cas13a是CRISPR-Cas家属中独一一种可以靶向单链RNA的效应卵白,且具有非特异性反式切割临近单链RNA的活性,这些特征可以靶向辨认目的RNA并使用陈诉分子的断裂将信号缩小,为使用CRISPR-Cas13检测RNA病毒SARS-CoV-2提供了时机。华裔学者张锋团队创建的一种基于Cas13a的特异高敏捷度酶陈诉体系(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK)已被用于检测SARS-CoV-2,在42个RNA拷贝的检出限内荧光读数的敏捷度和特异性均为100%,横向活动读数敏捷度和特异性辨别为97%、100%。Arizti-Sanz等创建的简化突出表现熏染以应对盛行病的办法(streamlined highlighting of infections to navigate epidemics,SHINE)完成免样本核酸提取且将等温扩增和基于Cas13的检测交融为一步,在延长检测工夫的同时可进步敏捷度,后果可以经过管内荧光读数举行可视化并由配套的智能手机使用步伐举行解读,增加净化危害。Rauch等设计的巩固、九游会、可扩展的基于CRISPR-Cas13a的检测办法(Cas13-based, rugged, equitable, scalable testing,CREST)将RT-PCR扩增与Cas13a酶相联合,设置装备摆设只包罗浅易玲珑的热循环仪和基于塑料过滤器的LED显像仪,分外合适现场检测,且本钱低,敏捷度高。

2.2、基于CRISPR-Cas12的COVID-19诊断

Cas12异样有反式切割活性,但只能靶向切割双链DNA,使用逆转录等温扩增技能可让基于CRISPR-Cas12的检测办法完成对SARS-CoV-2或其他RNA病毒的检测,原理与Cas13类似。迩来张锋团队公布了更浅易的SARS-CoV-2核酸检测办法STOPCovid(SHERLOCK testing in one pot),把逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)和SHERLOCK兼并举行,敏捷度与qRT-PCR相称,最大好处是不必要从患者样本中提取和纯化RNA,检测SARS-CoV-2只需在一个试管中一步完成,阳性样本只需15~45 min就能取得后果,分外适于POCT场景利用。Broughton等将后期创建的基于CRISPR-Cas12a的针对DNA内切酶靶向的CRISPR反式陈诉检测体系(DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter,DETECTR)和RT-LAMP技能联合,可检测SARS-CoV-2 N和E基因。Ding等[18]设计的多合一的双CRISPR-Cas12a检测技能(all-in-one dual CRISPR-Cas12a,AIOD-CRISPR)不必要预扩增和分散扩减产物,该办法使用一对Cas12a CRISPR RNA(crRNA)复合物联合目的序列的差别位点,且不受Cas12a前间区序列临近基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列的限定,检测后果在蓝色LED灯配景下可间接用肉眼读出。另一种基于CRISPR-Cas12a的肉眼读出检测办法(CRISPR/Cas12a-based-detection with naked eye readout,CRISPR/Cas12a-NER)使用逆转录重组酶介导等温核酸扩增技能(reverse transcript recombinase-aided amplification,RT-RAA)对SARS-CoV-2举行预扩增,后果切合率达100%。别的,Zhang等初次联合金纳米颗粒(gold nanoparticle,AuNP)创建了Cas12a帮助的RT-LAMP/AuNP检测(Cas12a-assisted RT-LAMP/AuNP,CLAP),该检测可同时在96孔板中举行,仅经过肉眼或平凡的酶标仪就能读出后果,具有扩展到主动化检测平台的潜力,这种高通量的检测办法将很大水平地改良以后COVID-19的疾速筛查事情。图1展示了几种次要的基于CRISPR-Cas12/13的COVID-19分子诊断技能原理。



2.3、基于其他CRISPR-Cas体系的COVID-19诊断

Cas9、Cas3等其他CRISPR-Cas体系固然没有反式切割活性,无法完成游离报道分子的信号缩小,但使用其靶向联合的活性异样可以正确检测出SARS-CoV-2的RNA序列。基于Cas3操纵的核酸检测办法(Cas3-operated nucleic acid detection,CONAN),最快能在40 min内检测出单拷贝SARS-CoV-2 RNA。Azhar等初次开辟出一种基于CRISPR-Cas9体系检测SARS-CoV-2的办法FELUDA(FnCas9 editor linked uniform detection assay),试剂盒已获准在印度上市贩卖。该法无需对陈诉分子举行反式切割,间接使用Cas9的酶切作用举行核酸检测,正确度与qRT-PCR检测类似,而且在检测致病性单核苷酸变异和核酸序列剖析方面正确度也很高。表1列出了qRT-PCR以及种种基于CRISPR-Cas体系的SARS-CoV-2核酸检测办法的功能特性。



3、基于CRISPR-Cas体系的抗SARS-CoV-2医治及防备战略

3.1、基于CRISPR-Cas体系的抗SARS-CoV-2医治

已有报道证明Cas13d可被编程用于九游会克制哺乳植物体内多种单链RNA病毒而不会丧失目的基因,Cas13d具有靶向多个地区的才能且有更强的催化活性,不必要任何严厉的PAM/前间区序列侧翼序列来限定切割靶点,这使得CRISPR-Cas13d成为抗病毒医治研发的热门。Abbott等[25]以CRISPR-Cas13d为底子开辟了一种新技能,人类细胞中的防备性抗病毒CRISPR(prophylactic antiviral CRISPR in human cell,PAC-MAN)体系。经过对47例COVID-19和中东呼吸综合征患者的基因组序列举行比对,借助生物信息学流程创建了与人类基因组脱靶效应较小的针对高度守旧的RNA依赖的RNA聚合酶和N基因的crRNA文库,在人肺上皮细胞系中PAC-MAN对SARS-CoV-2的克制率辨别为85%和70%,研讨表现,PAC-MAN体系仅靠6个crRNA就足以靶向切割包罗SARS、中东呼吸综合征和COVID-19相干的β冠状病毒在内的凌驾90%的冠状病毒基因,证明PAC-MAN可以成为一种潜伏的抗SARS-CoV-2战略。但是怎样宁静无效地将CRISPR组件递送至人体细胞中并继续发扬作用是基于CRISPR-Cas体系的新型抗病毒医治使用于临床的次要困难。腺相干病毒(adeno-associated virus,AAV)或慢病毒载体是病毒载体递送体系的代表,为了将Cas无效地递送到受熏染细胞中,张峰团队发明了一种最小的Cas13效应卵白Cas13bt(仅有其他Cas13卵白的一半巨细),可被间接装入单个AAV载体内举行递送,Nguyen等[28]使用肺特异性AAV血清型载体将Cas13d效应卵白和针对SARS-CoV-2 ORF1ab和S基因的特异性crRNA通报至SARS-CoV-2熏染者肺上皮细胞,降解了SARS-CoV-2基因组克制病毒复制。

别的,抗体与Cas酶交融(antibody and Cas fusion,ABACAS)技能可以经过将Cas13核酸酶与SARS-CoV-2的S卵白特异性抗体片断交融来完成CRISPR组件的毗连,ABACAS的抗体片断将辨认SARS-CoV-2上的S卵白,并促进Cas13与病毒一同选择性地递送至受熏染细胞中,一旦ABACAS被通报到受熏染的细胞,它就会辨认并切割病毒RNA,依托病毒自己的选择性通报也可增加构造外效应。ABACAS技能除了选择性递送CRISPR-Cas体系外,ABACAS抗体片断的中和活性还大概会搅扰S卵白和血管告急素转化酶2受体的互相作用,并最大限制地增加病毒进入宿主细胞。非病毒载体递送包罗脂质纳米颗粒法、电穿孔法、核转染法、显微注射法等,此中脂质纳米颗粒法以其无毒性、低免疫原性、可增长Cas酶在体外和体内表达工夫的好处锋芒毕露[fēng máng bì lù]。Blanchard等将分解的Cas13a mRNA和针对SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的crRNA的脂质纳米聚合物经过雾扮装置保送到受熏染仓鼠的呼吸道,后果标明CRISPR-Cas13a可以增加仓鼠体内SARS-CoV-2的复制并加重症状。分解的mRNA使Cas13a效应子在仓鼠体内瞬时表达,很大水平加重了免疫应对,也增加了mRNA与受试者本身遗传物质整合的大概性。Fareh等报道了一种可编程的CRISPR-pspCas13b针对SARS-CoV-2的S、N基因转录后的mRNA,克制具有熏染复制才能的SARS-CoV-2,包罗山公和人类上皮细胞中的未变异株、D614G变体和近来饱受存眷的B.1.1.7变体。该研讨的综合渐变剖析进一步证明单个crRNA对单核苷酸错配具有耐受性,并对新变种中呈现的渐变RNA仍坚持催化活性,为开辟可以克制宽大SARS-CoV-2渐变体的医治战略提供了观点验证。但是,这些研讨还必要更普遍的临床前研讨,还必要进一步理解其免疫原性、CRISPR组件的递送、Cas卵白表达的工夫,以及脱靶效应等题目。

3.2、基于CRISPR-Cas体系的COVID-19防备

现在已有多篇使用CRISPR-Cas9体系构建开辟植物疫苗候选毒株的报道。譬如使用CRISPR-Cas9体系构建伪狂犬病病毒基因缺失的疫苗候选毒株;使用CRISPR-Cas9体系敲除非洲猪瘟病毒强毒株中的非必须基因8-DR,为后续非洲猪瘟疫苗的研制奠基底子;使用CRISPR-Cas9体系敲除毒力因子,并将异源基因拔出禽类易感的疱疹病毒科感染性喉气管炎病毒基因组中,以发生多价禽疱疹病毒重组疫苗等[33]。CRISPR-Cas体系经过基因敲除、交换或拔出对病毒基因组举行修饰,构建具有多种重组基因疫苗候选毒株,为人用病毒性疫苗的研讨提供了一条新的无效途径。别的,使用CRISPR-Cas9体系在编辑哺乳植物细胞基因组方面的正确性,大概可以改革植物体内B细胞的基因组,使B细胞间接表达出高效价的特异性抗体以防备病毒熏染。Faiq[34]提出假定,使用CRISPR-Cas9编辑B细胞基因组以表达针对差别抗原的单克隆抗体,并经过在宿主B细胞基因组中拔出表达针对SARS-CoV-2抗体的核酸序列,大概在不引入病毒外表卵白或多肽的状况下表达出抗SARS-CoV-2抗体。这将能消弭反复注射的必要,同时可以在一个月内完成无效反抗某种病毒的爆发。毫无疑问,基于CRISPR-Cas体系的基因编辑技能为设计、研发、消费出更疾速、更宁静、更多价的诸如COVID-19疫苗等重组病毒疫苗提供了新的大概的妙技[miào jì]。

4、小结与瞻望

COVID-19活着界范畴内的大盛行招致人类消费生存和生命安康遭到严峻侵害,疾速及时的分子诊断检测技能、实在无效的新型医治及防备战略成为克服环球疫情的要害。PCR和DNA测序技能的开展促进了对新发病原体的疾速检测才能,成为疫情初期最无力的诊断东西。基于CRISPR-Cas体系的分子诊断技能已被证明具有敏捷、特异、疾速、便宜的好处,在资源有限的地域,基于横向活动试纸条的疾速检测办法可以很容易地检测SARS-CoV-2病毒核酸,大范围使用这些办法筛查受熏染人群(或居家自我监测)将有助于限定病毒传达。固然这些技能只要一般取得FDA的EUA(美国Sherlock Biosciences公司开辟的SHERLOCK™ CRISPR SARS-CoV-2和Mammoth Biosciences公司的SARS-CoV-2 DETECTR™核酸检测试剂盒),但随着更多试剂研产生产企业的到场,越来越多的基于CRISPR-Cas的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒将会连续进入临床利用,大概在不久的未来替换qRT-PCR成为分子诊断范畴的主流。别的,寻觅更无效的COVID-19抗病毒医治及防备手腕,也是天下列国学者现在研讨的重点及难点。PAC-MAN和ABACAS是基于CRISPR-Cas体系用于COVID-19医治中的代表性示例,只需设计出针对病毒守旧序列的crRNA,就能靶向降解病毒核酸克制病毒增殖,有助于进步将来应对变异病毒或新病毒爆发的才能。评价利用CRISPR的潜伏危害关于其将来的临床使用非常紧张,研发符合的通报体系以包管CRISPR的专注性、宁静性和高效性,并扫除脱靶效应所致渐变及肿瘤的产生危害,是现在PAC-MAN等技能使用于COVID-19患者医治急需办理的困难地点。别的,CRISPR-Cas体系使用于新型病毒性疫苗的研发,将大大延长疫苗研发周期,为应对诸如COVID-19这类流行症[liú háng zhèng]的大盛行提供全新的防备战略及办理方案。


作者:刘锦嵩  鄢盛恺,遵义医科大学查验医学院

通讯作者:鄢盛恺

本文泉源:国际生物成品学杂志 

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